多肽合成的基本知識(shí)

1、多肽合成的基本原理是什么？

多肽固相合成法是多肽合成化學(xué)的一個(gè)重大的突破。它的最大特點(diǎn)是不必純化中間產(chǎn)物，合成過(guò)程可以連續(xù)進(jìn)行，進(jìn)而為多肽合成的自動(dòng)化奠定了基礎(chǔ)。目前全自動(dòng)多肽的合成，基本都是固相合成。其基本過(guò)程如下：基于Fmoc化學(xué)合成，先將所要合成的目標(biāo)多肽的C-端氨基酸的羧基以共價(jià)鍵形式與一個(gè)不溶性的高分子樹(shù)脂相連，然后以這一氨基酸的氨基作為多肽合成的起點(diǎn)，同其它的氨基酸已經(jīng)活化的羧基作用形成肽鍵，不斷重復(fù)這一過(guò)程，即可得到多肽。根據(jù)多肽的氨基酸組成不同，多肽后處理方式不同，純化方式也有差異。

2.多肽定制服務(wù)的質(zhì)量如何控制？

多肽嚴(yán)格按照ISO質(zhì)量管理體系進(jìn)行生產(chǎn)，對(duì)每條多肽都進(jìn)行唯一的編號(hào)管理，對(duì)粗品、純化收集液以及最終凍干品進(jìn)行HPLC以及LC/MS檢測(cè)分析，確保產(chǎn)品的正確性和產(chǎn)品的質(zhì)量。

3.生物多肽的專業(yè)技術(shù)以及交貨時(shí)間如何？

在多肽化學(xué)合成技術(shù)方面積累了多項(xiàng)國(guó)際領(lǐng)先的困難多肽合成技術(shù)，能夠借助多肽片段合成和多肽連接技術(shù)實(shí)現(xiàn)了長(zhǎng)鏈多肽的化學(xué)合成；掌握高度疏水的膜蛋白片段合成的增溶技術(shù)，完全應(yīng)用化學(xué)合成方法實(shí)現(xiàn)了目前國(guó)際上最長(zhǎng)的膜蛋白化學(xué)全合成，多次刷新了世界紀(jì)錄；并且應(yīng)用替代二硫鍵的非天然氨基酸技術(shù)實(shí)現(xiàn)了多肽環(huán)化修飾，將使得合成的多肽藥物更為穩(wěn)定。普通多肽可以一周時(shí)間交貨，大部分可以二周內(nèi)交貨。數(shù)量從毫克到公斤級(jí)。

4.什么是多肽的凈含量（肽含量），它的意義是什么？

干品多肽的重量中不僅僅包含多肽，還包含有一些非肽的組份，如水，被吸收的溶劑、配位離子和鹽等。肽的凈含量是指肽在其中的重量百分比，這個(gè)百分比的數(shù)值范圍很大，可能從50%到90%，取決于純度、序列以及合成和純化的方法，不要將肽的凈含量和肽的純度混為一談，它們是完全不同的兩個(gè)概念。純度通常是由HPLC決定的。純度定義的是多肽樣品中含正確序列的組分的百分比，而肽的凈含量是指樣品中肽類物質(zhì)相對(duì)于非肽類物質(zhì)所占的百分比，肽的凈含量通常是用氨基酸組分分析或紫外分光法測(cè)定的。這個(gè)信息主要是在一些對(duì)肽的濃度很敏感的實(shí)驗(yàn)中，對(duì)計(jì)算肽的濃度是很重要的。

5.如何保存合成的多肽？

多肽一般長(zhǎng)期保存需要避光保存，并應(yīng)保存在-20度，短期可以保存在4度?？梢远虝r(shí)間以室溫運(yùn)輸。多肽在-20℃很穩(wěn)定，特別是冷凍干燥并保存在干燥器中，在將它們暴露于空氣之前，冷凍干燥多肽可以放于室溫。這將是濕度影響減少，當(dāng)無(wú)法冷凍干燥時(shí)，最好的方法是以小的工作樣量存放。對(duì)于含Cys,Met orTrP的多肽，脫氧緩沖劑對(duì)其溶解必不可少，因?yàn)檫@種多肽可易空氣氧化，在封瓶前，慢慢流過(guò)多肽的氮?dú)饣驓鍤庖矔?huì)降低氧化作用。含Gln或Asn的多肽也容易降解，所有這些肽與不含這些有問(wèn)題簡(jiǎn)單的那些肽相比，生命期有限。

6.為什么有些多肽的合成產(chǎn)率或純度會(huì)比較低?

多肽合成與引子合成有比較大的區(qū)別，不能合成的引子很少，但是不能合成的多肽經(jīng)常有。如Val,Ile,Tyr,Phe,Trp,Leu,Gln,和Thr這些氨基酸比鄰或重復(fù)時(shí)，多肽鏈在合成過(guò)程中不能完全舒展溶解，合成效率下降。以下幾種情形，合成效率和產(chǎn)物的純度都比較低，如：重復(fù)Pro,Ser-Ser，重復(fù)Asp，4個(gè)連續(xù)Gly等。

7.如果我的肽純度是95%，那么，其余的5%都是些什么物質(zhì)？

多肽的純度通常是通過(guò)HPLC，用每分鐘1%的標(biāo)準(zhǔn)乙晴梯度來(lái)檢測(cè)決定的。合成過(guò)程中，氨基酸之間的交聯(lián)效率不是總能達(dá)到100%，因而產(chǎn)生一系列的氨基酸缺失的雜質(zhì)。大多數(shù)這樣的氨基酸缺失的雜質(zhì)在純化過(guò)程中都被去掉了，但有少數(shù)的雜質(zhì)其色譜表現(xiàn)與目標(biāo)多肽很相近。這些氨基酸缺失的雜質(zhì)肽留在了多肽樣品中就構(gòu)成了余下的幾個(gè)百分。

8.多肽是如何純化的?

多肽純化一般使用反相柱(如C8，C18等)，214nm。緩沖體系通常為含TFA的溶劑，pH2.0。Buffer A為含0.1%TFA in ddH2O，Buffer B為1%TFA/ACN/pH2.0。純化前用Buffer A溶解;如果溶解不好，用Buffer B溶解后，然后用Buffer A稀釋;對(duì)疏水性強(qiáng)的多肽，有時(shí)還需要加入少量的Formic Acid或醋酸。HPLC分析多肽粗產(chǎn)物，如果多肽不長(zhǎng)(15aa以下)，一般會(huì)有主峰，主峰通常為全長(zhǎng)產(chǎn)物;對(duì)于20aa以上的長(zhǎng)肽，如果沒(méi)有主峰，HPLC需搭配Mass來(lái)判定分子量，進(jìn)而確定哪個(gè)峰是所要合成的多肽。

9.如何從多肽序列中判定多肽的溶解性?

(1)多肽中如果含有高比例的疏水性很強(qiáng)的氨基酸如和Leu,Val,IIe,Met,Phe和Trp，多肽很難溶解與水性溶液中或根本不可能溶解。這些氨基酸無(wú)論是純化或合成，都有可能有問(wèn)題。

(2)一般情況下疏水性氨基酸的比例<50%，不能連續(xù)5個(gè)連續(xù)氨基酸為疏水性，帶電荷的氨基酸的(正電荷K,R,H,N-terminus,負(fù)電荷D,E,C-terminus)的比例達(dá)到20%，在多肽的N或C短如果能增加極性氨基酸，也可以改善溶解性。

10.多肽與其他化合物或者載體接合考慮的因素有那些？

經(jīng)常有一些多肽需要與一些藥物或者特定功能的化合物進(jìn)行連接，或者要把多肽連接到某些載體上去，需要化學(xué)鍵進(jìn)行結(jié)合，一般多肽具有氨基或羧酸官能團(tuán)可以考慮下相應(yīng)的羧酸或氨基進(jìn)行縮合，另外一種選擇是通過(guò)巰基（thiol）與馬來(lái)酰亞胺（Maleimide）在PH 8的環(huán)境下連接。多肽中可以通過(guò)帶有Cys或者M(jìn)aleimide官能團(tuán)進(jìn)行修飾。Maleimide修飾通?？梢赃x擇化合物3-Maleimidopropionic Acid(CAS 7423-55-4)實(shí)現(xiàn)。